AGAR NA WĘGIEL
Kod: CM0119
Pożywka do uprawy i izolacji Bordetella pertussis i Haemophilus influenzae
Typowa formuła * gm / litr
Proszek „Lab-Lemco” 10,0
Pepton 10,0
Skrobia 10,0
Węgiel bakteriologiczny 4.0
Chlorek sodu 5.0
Kwas nikotynowy 0,001
Agar 12,0
pH 7,4 ± 0,2 w 25 ° C
* Dostosowane zgodnie z wymaganiami w celu spełnienia standardów wydajności
Sposób użycia
Zawiesić 51 g w 1 litrze wody destylowanej. Doprowadzić do wrzenia, aby całkowicie się rozpuściły. Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Ochłodzić do 50 ° C, dodać 10% defibryfikowanej krwi i delikatnie wymieszać. Pożywka jest selektywna do izolacji Bordetella pertussis i Bordetella parapertussis przez dodanie Bordetella Selective Supplement SR0082.
Do jednej fiolki dodać 2 ml sterylnej wody destylowanej i całkowicie rozpuścić zawartość. Dodaj ten roztwór do 500 ml jałowego, stopionego agaru z węgla drzewnego, schłodzonego do 50 ° C, razem z 10% obj./obj. Defibrylowaną krwią końską SR0050. Dobrze wymieszaj przed przelaniem do sterylnych szalek Petriego.
W przypadku Haemophilus influenzae pomiń środki selekcyjne i przekonwertuj na agar „czekoladowy”.
Środek transportowy dla Bordetella pertussis
Zawartość fiolki można dodać do 500 ml agaru z węglem drzewnym o połowie mocy + 10% v / v defibrylowanej krwi końskiej SR0050 do zastosowania jako środek transportowy dla B. pertussis.
Opis
Agar z węglem drzewnym został opracowany przez Oxoid w celu zapewnienia podłoża niezawierającego krwi do hodowli Bordetella pertussis i Haemophilus influenzae. Proom1 wykazał, że kwas nikotynowy był niezbędnym czynnikiem wzrostu dla bordetelli. Ensminger i in. 2 wykorzystali węgiel drzewny do wzrostu Bordetella pertussis w produkcji szczepionek i stwierdzili, że podłoże to może zastąpić Bordet-Genou. Mishulow i in. 3 zastosowali agar z węglem drzewnym do uprawy Bordetella pertussis.
Haemophilus influenzae hoduje się na pożywce zawierającej 10% „zdławionej” krwi, ale bez antybiotyków. Zaszczepioną płytkę inkubuje się przez 2 do 3 dni w 37 ° C. Kolonie są zwykle małe, przezroczyste i przypominają kropelki, ale może dojść do transformacji do kolonii typu „szorstkiego”. Różnicowanie gatunków przeprowadza się poprzez badanie zapotrzebowania na czynniki wzrostu X i V, na podstawie agaru z krwią CM0055.
Największym problemem w izolacji gatunków Bordetella z wydzielin nosowo-gardłowych jest tłumienie niechcianej flory podczas długiego okresu inkubacji na bardzo pożywnych podłożach.
Pierwsza demonstracja penicyliny przeprowadzona przez Fleminga miała wykazać, że może ona pomóc w izolacji Bordetella pertussis na podłożu medialnym4. Lacey5 potwierdziło to, ale stwierdziło, że flora oporna na penicylinę nadal powodowała problemy. Uzupełniał penicylinę 2 µg / ml dichlorowodorku diamidyno-difenyloaminy 2 µg / ml (M & B 938), zwiększając w ten sposób selektywność tego ośrodka.
Broome i wsp. 6 stwierdzili, że metycylina jest lepsza od penicyliny w tłumieniu niepożądanej flory nosowo-gardłowej, ale wcześniejsza publikacja Sutcliffe i Abbott7, w której wykazano, że cefaleksyna (40 µg / ml) przewyższa penicylinę, okazała się być najbardziej znaczącym postępem .
Korzyści z cefaleksyny jako selektywnego środka przeciwko Bordetella pertussis zostały potwierdzone 8,9,10,11. Zdolność do regeneracji komórek poddanych stresowi i znacznie dłuższy okres trwałości (6-8 tygodni) są dodatkowymi zaletami jego przewagi w hamowaniu niepożądanego wzrostu nosogardzieli.
Regan i Lowe8 wykazali, że agar Oxoid Charcoal o połowie mocy, uzupełniony lizowaną cefaleksyną SR0082 v / v o stężeniu 40 µg / ml, defibryfikowana krew końska była doskonałym środkiem wzbogacającym i transportującym.
Skuteczność tego środka transportu została potwierdzona przez innych pracowników12.
Technika
Zalecana jest następująca technika diagnostyki laboratoryjnej krztuśca11.
1. Zbierz wymazy z jamy ustnej we wczesnym stadium choroby i umieść w probówkach agaru z węglem drzewnym o połowie mocy uzupełnionego 10% v / v lizowaną, defibryfikowaną krwią konia i 40 mg / ml cefaleksyny.
2. Obficie zaszczepić waciki grubymi warstwami agaru z węglem drzewnym zawierającym 10% v / v defibryfikowanej krwi końskiej i 40 µg / ml cefaleksyny (SR0082).
Ponadto można zastosować nieselektywne podłoże, w którym pominięto cefaleksynę.
3. Wykonaj bezpośrednie testy przeciwciał fluorescencyjnych (DFA) na wydzielinach, używając surowic odpornościowych Bordetella pertussis i Bordetella parapertussis, aby pomóc w postawieniu wcześniejszej diagnozy.
4. Wymień gaziki na oryginalny nośnik i trzymaj w temperaturze pokojowej. Jeśli płytki hodowlane zarosną komensalną florą lub grzybami, użyj wymazów, aby zaszczepić świeże płytki podłoża.
5. Inkubuj płytki w temperaturze 35 ° C w wilgotnej atmosferze (60-70% wilgotności) przez maksymalnie sześć dni. Zbadaj płytki po 40 godzinach inkubacji, a następnie dwa razy dziennie.
6. Szukaj małych, błyszczących, szarawobiałych, okrągłych wypukłych kolonii. Podejrzane kolonie powinny zostać zabarwione metodą Grama przy użyciu dwuminutowej kontrastowej barwy safraniny. Niektóre komórki pleomorficzne mogą być widoczne, spowodowane przez cefaleksynę w pożywce selektywnej.
7. Potwierdź identyfikację za pomocą testów DFA podejrzanych kolonii.
